CY5和CY5.5是兩種常用的遠(yuǎn)紅區(qū)（發(fā)射波長(zhǎng)大于640 nm）熒光探針，因其光譜具有更強(qiáng)的組織穿透能力和更低的背景熒光而備受青睞。由于CY5/CY5.5的熒光成像相對(duì)比較特殊，對(duì)于常規(guī)熒光顯微鏡來(lái)說(shuō)，需要提升CY5/CY5.5的熒光成像效果，通常是從以下四個(gè)維度做出改進(jìn)，1.攝像頭；2.熒光光源；3.熒光濾色片組；4.熒光物鏡；Mshot明美將從以上四個(gè)方面推出系列分享文章，今天我們留重點(diǎn)從攝像頭的維度來(lái)分享下如何提升CY5/CY5.5的熒光成像效果。

為什么CY5/CY5.5的熒光成像攝像頭選擇比較困難？對(duì)應(yīng)我們常規(guī)熒光顯微鏡的攝像頭選擇，一般是高靈敏度的彩色攝像頭方案，應(yīng)對(duì)最常見(jiàn)的DAPI,FITC,GFP,RFP,Mcherry 等熒光觀察和拍攝記錄，常規(guī)光譜響應(yīng)范圍380-650nm，同時(shí)一般在相機(jī)前端會(huì)配置有IR紅外阻擋片用來(lái)過(guò)濾紅外雜散光，確?？梢?jiàn)光區(qū)的成像效果。而CY5/CY5.5發(fā)射波峰值分別去到了670nm和707nm，對(duì)于常規(guī)攝像頭來(lái)說(shuō)，熒光信號(hào)基本被屏蔽了，因此很多時(shí)候常規(guī)相機(jī)往往是捕捉不到CY5/CY5.5的熒光信號(hào)。

去掉相機(jī)紅外截止濾光片能提升效果嗎？既然紅外截止濾光片影響成像，那去掉這個(gè)濾光片，是不是就可以獲得跟黑白相機(jī)一樣的成像效果呢？答案是不一定。首先去掉紅外截止濾光片有代價(jià)，就是基本犧牲了明場(chǎng)成像。650nm以上的紅外信號(hào)會(huì)干擾彩色成像，使相機(jī)難以還原目鏡看到的真實(shí)色彩，并且這種偏紅超出白平衡設(shè)置能修正的范圍，拍攝HE染色片等明場(chǎng)樣品會(huì)有影響；第二個(gè)問(wèn)題是傳感設(shè)計(jì)問(wèn)題可能導(dǎo)致效果不佳。普通的彩色相機(jī)可能是前照式CMOS，在近紅外區(qū)域的光子效率并不理想，移除紅外截止濾光片并不能改善這個(gè)問(wèn)題。而如果是BSI背照式CMOS，則在近紅外區(qū)域也有比較好的光子效率，成像雖然達(dá)不到BSI背照式sCMOS那么好，但屬于可用級(jí)別；最后一個(gè)是個(gè)微觀細(xì)節(jié)問(wèn)題，但卻是大問(wèn)題。彩色相機(jī)傳感前有個(gè)色彩濾波陣列(Color Filter Array)，用來(lái)根據(jù)波長(zhǎng)對(duì)光線進(jìn)行濾波，比如典型的拜爾RGB濾鏡，每個(gè)像元有RGGB四格三色，R紅光只能通過(guò)1/4格空間到達(dá)傳感，也就是說(shuō)，到達(dá)傳感的R紅光進(jìn)光量只有25%.而黑白相機(jī)沒(méi)有色彩濾波陣列，R紅光進(jìn)光量是100%，所以成像信號(hào)強(qiáng)度會(huì)好很多。

部分高靈敏度彩色相機(jī)可能會(huì)采用RYYB或者RCCB的色彩濾波陣列，Y濾波可以通過(guò)綠色和紅色的波長(zhǎng)，C全透則是可以通過(guò)全部可見(jiàn)光波長(zhǎng)，這兩種色彩濾波陣列的R紅光進(jìn)光量可能達(dá)到50-75%，更有利于獲得接近黑白相機(jī)的靈敏度，但目前并不普遍。